傳代培養(yǎng)

傳代：去除原培養(yǎng)基并將細(xì)胞從原培養(yǎng)體系轉(zhuǎn)系到新鮮的生長培養(yǎng)基中，該過程可使細(xì)胞系或細(xì)胞株進(jìn)一步增殖。

接種后培養(yǎng)細(xì)胞的生長將從延滯期進(jìn)入對數(shù)期，細(xì)胞呈指數(shù)增殖。當(dāng)貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞已占據(jù)所有可用基質(zhì)、沒有擴(kuò)增空間，或者懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞已超過培養(yǎng)基所能支撐的能力，無法進(jìn)一步生長時(shí)，細(xì)胞增殖速度將大大降低甚至完全停止。為了將細(xì)胞密度維持在最佳水平，以便細(xì)胞繼續(xù)生長，并且刺激其進(jìn)一步增殖，必須將培養(yǎng)物分成若干部分，并添加新鮮培養(yǎng)基。

如上為培養(yǎng)細(xì)胞的典型生長模式圖

如上半對數(shù)圖顯示了細(xì)胞密度與培養(yǎng)時(shí)間之間的關(guān)系。培養(yǎng)中的細(xì)胞通常按照標(biāo)準(zhǔn)生長模式增殖。細(xì)胞接種后第一個(gè)生長階段是延滯期，此階段細(xì)胞生長緩慢，處于適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境、為快速生長做準(zhǔn)備的狀態(tài)。延滯期之后是對數(shù)期，此階段細(xì)胞呈指數(shù)增殖，消耗生長培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素。當(dāng)所有生長培養(yǎng)基均被耗盡 (一種或多種營養(yǎng)素耗竭) 或者細(xì)胞已占據(jù)所有可用基質(zhì)時(shí)，細(xì)胞即進(jìn)入靜止期，也稱平臺期，其增殖速度大大降低甚至完全停止。

何時(shí)傳代？

貼壁培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)即應(yīng)進(jìn)行傳代。正常細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)會停止生長 (接觸抑制)，重新接種后需要較長時(shí)間才能恢復(fù)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞即使達(dá)到匯合狀態(tài)也能繼續(xù)增殖，但是在經(jīng)過大約兩個(gè)倍增時(shí)間后通常會變質(zhì)。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)也應(yīng)進(jìn)行傳代。達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會聚集成團(tuán)塊，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時(shí)培養(yǎng)基會變得渾濁。

如上圖為HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)過程中的不同密度情況：由左至右：圖1為培養(yǎng)2天后，細(xì)胞密度約為40%，此時(shí)細(xì)胞密度偏低，不宜進(jìn)行傳代；圖2為培養(yǎng)3天后，細(xì)胞密度約為80%，此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代；圖3為培養(yǎng)4天后，細(xì)胞已經(jīng)幾乎長滿，此時(shí)的細(xì)胞密度約為97%~100%，這時(shí)再進(jìn)行傳代就太晚了。

乳酸是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，生長培養(yǎng)基 pH值降低通常表示乳酸蓄積。乳酸有細(xì)胞毒性，而且pH值降低也是細(xì)胞生長的不利因素。pH值改變的速度通常取決于培養(yǎng)體系中的細(xì)胞濃度，細(xì)胞濃度越高，培養(yǎng)基耗竭的速度越快。如果發(fā)現(xiàn) pH值迅速降低(> 0.1–0.2 pH 單位)，同時(shí)細(xì)胞濃度增大，則應(yīng)對細(xì)胞進(jìn)行傳代。

嚴(yán)格按照預(yù)定時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞傳代可確保細(xì)胞的生物學(xué)行為穩(wěn)定，便于監(jiān)測其健康狀態(tài)。從某一接種密度開始逐漸調(diào)整細(xì)胞接種密度，直到達(dá)到適合該細(xì)胞的穩(wěn)定生長速度和產(chǎn)量。細(xì)胞偏離確定的生長模式通常表示細(xì)胞健康狀況不佳(例如：變質(zhì)、污染)或者培養(yǎng)體系的某一組分功能異常(例如：未達(dá)到最佳溫度，培養(yǎng)基過于陳舊)。

建議保留詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)記錄，記錄處理及傳代時(shí)間、所用培養(yǎng)基種類、解離方法、分種率、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果、接種濃度、產(chǎn)量和抗生素用法。最好按照傳代時(shí)間安排開展實(shí)驗(yàn)和其他非常規(guī)操作(如更換培養(yǎng)基種類)。如果您的實(shí)驗(yàn)安排與常規(guī)傳代時(shí)間安排不吻合，則應(yīng)確保當(dāng)細(xì)胞仍處于延滯期或者已經(jīng)達(dá)到匯合狀態(tài)、停止生長時(shí)，不進(jìn)行傳代。