細(xì)胞在培養(yǎng)過程中容易受到支原體的污染，往往對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生非常不好的影響，發(fā)現(xiàn)的早則耽誤些功夫重新培養(yǎng)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)的晚可能一段時(shí)間內(nèi)的實(shí)驗(yàn)都白做了，那么如何通過不同的檢測方法檢測到支原體的蹤跡？
支原體是非常微小的微生物，其直徑只有0.2-0.8µm，是細(xì)胞培養(yǎng)中令人頭疼的大問題。關(guān)鍵是其污染源簡直來自四面八方：
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培養(yǎng)基
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血清
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實(shí)驗(yàn)操作者
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會(huì)影響：
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細(xì)胞生長率
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細(xì)胞形態(tài)
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基因表達(dá)
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細(xì)胞代謝和細(xì)胞活力。
支原體感染不易察覺，因此對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測就非常重要。
污染實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)細(xì)胞的支原體主要有八種，但還沒有哪種檢測方法能夠單槍匹馬把這八種支原體都檢測出來。支原體非常頑強(qiáng)，通常用于細(xì)胞培養(yǎng)的絕大多數(shù)抗生素都對其無效。例如青霉素主要作用于細(xì)菌細(xì)胞壁，但支原體沒有細(xì)胞壁因此就不受影響。
無懈可擊的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)始終是預(yù)防支原體感染的最佳方式，另外及時(shí)找出受到支原體感染的培養(yǎng)物也很重要，這樣才能在感染擴(kuò)散前快速采取有效措施。刀王就為你介紹幾種在培養(yǎng)細(xì)胞中檢測支原體的常用方法。
分離培養(yǎng)法
分離培養(yǎng)法是支原體檢測的金標(biāo)方法，其檢測精確度最高。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上瘋狂生長，最終形成明顯可見的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽(yù)為支原體檢測金標(biāo)準(zhǔn)。
不過分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端：
一是檢測時(shí)間太長，支原體要長出明顯克隆至少需要4周時(shí)間；
二是盡管可以檢測絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M.hyorhinis。
如果你實(shí)在不想等這么久，或者希望在分離培養(yǎng)法的等待過程中先拿到初步結(jié)果，你可以試一試DNA、PCR或酶學(xué)檢測方法。不過需要注意的是，上述檢測方法都不能單獨(dú)檢出所有類型的支原體，而且靈敏度也沒有分離培養(yǎng)法高，所以最好結(jié)合使用兩種方法以獲得最可靠的檢測結(jié)果。
DNA檢測
DNA檢測需要將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，因此一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細(xì)胞的核周圍觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。分離培養(yǎng)法用來檢測支原體M.hyorhinis菌株并不可靠，而DNA法可以準(zhǔn)確的將其檢測出來。
PCR法
PCR法也可以檢測M.hyorhinis菌株，PCR法檢測支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測方法。該方法采用針對支原體DNA的引物用PCR檢測可疑樣本，其中PCR引物通常針對支原體的16S rRNA基因。在凝膠電泳過程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。PCR法可以檢測大多數(shù)支原體，但謹(jǐn)慎起見最好同時(shí)使用另一種檢測方法來進(jìn)行驗(yàn)證。
酶學(xué)檢測和ELISA
此外，也還存在一些其他支原體檢測方法。例如酶學(xué)檢測是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。ELISA也能用于支原體檢測，以ELISA法為基礎(chǔ)的支原體檢測一般使用針對支原體16S rRNA基因的帶標(biāo)記探針或抗體，來檢測培養(yǎng)物中是否含有支原體。
定期檢測
支原體感染會(huì)使培養(yǎng)細(xì)胞慢慢枯萎，因此對培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測非常重要。一般來說每1至3個(gè)月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測。將定期支原體檢測常規(guī)化堅(jiān)持下去，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對支原體感染的關(guān)鍵。
預(yù)防支原體污染的建議：
細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來預(yù)防支原體的污染：
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控制環(huán)境污染;
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嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作;
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細(xì)胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌;
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在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。
支原體污染細(xì)胞后，特別是重要的細(xì)胞株，有必要清除支原體，常用方法有
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抗生素處理
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抗血清處理
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抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理
支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，一般來講，對作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感;對多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮;其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細(xì)胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細(xì)胞，不會(huì)重新感染支原體。
支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)中實(shí)際上是比較常見的， 據(jù)資料，可達(dá)30%甚至更高。支原體污染時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)為長得不好，也不死亡，同時(shí)，培養(yǎng)基又是清亮的。時(shí)間長達(dá)一周也沒有什么變化。這時(shí)基本上可以判斷出是支原體污染了，愿意檢測就檢測一下，不愿意直接用清除試劑處理吧。
避免細(xì)胞污染，可以從預(yù)防著手，超凈工作臺物品放置要合理、進(jìn)入細(xì)胞房要換鞋和穿實(shí)驗(yàn)服、實(shí)驗(yàn)員戴手套后要用酒精等消毒、避免細(xì)胞交叉污染等等。
